核酸分子雜交實驗中的八大重要因素
（1）探針選擇：
根據不同的雜交實驗要求，應選擇不同的核酸探針。在大多數情況下，可以選擇克隆的DNA或cDNA雙鏈探針。但是在有些情況下，必須選用其它類型的探針如寡核苷酸探針和RNA探針。
1、檢測靶序列上的單個堿基改變時應選用寡核苷酸探針；
2、在檢測單鏈靶序列時應選用與其互補的DNA單鏈探針（通過克隆人M13噬菌體DNA獲得）或RNA探針，寡核苷酸探針也可；
3、檢測復雜的靶核苷酸序列和病原體應選用特異性較強的長的雙鏈DNA探針；
4、組織原位雜交應選用寡核苷酸探針和短的PCR標記探針（80～150bp），因為它易透過細胞膜進入胞內或核內。
（2）探針標記方法：
在選擇探針類型的同時，還需要選擇標記方法。探針的標記方法很多，選擇什么標記方法主要視個人的習慣和可利用條件而定。但在選擇標記方法時，還應考慮實驗的要求，如靈敏度和顯示方法等。一般認為放射性探針比非放射性探針的靈敏度高。
放射性探針的實際靈敏度不依賴于所采用的標記方法，如隨機引物延伸法往往得到比缺口平移法更高的比活性。在檢測單拷貝基因序列時，應選用標記效率高、顯示靈敏的探針標記方法。在對靈敏要求不高時，可采用保存時間長的生物素探針技術和比較穩定的堿性磷酸酶顯示系統。
（3）探針濃度：
隨探針濃度增加，雜交率也增加。在較窄的范圍內，隨探針濃度增加，敏感性增加。要獲得較滿意的敏感性，膜雜交中32P標記探針與非放射性標記探針的用量分別為5～10 ng/ml和25～1000ng/ml，而原位雜交中，無論應用何種標記探針，其用量均為0.5～5.0μg/ml。探針的任何內在物理特性均不影響其使用濃度，但受不同類型標記物的固相支持物的非特異結合特性的影響。
（4）雜交率：
傳統雜交率分析主要用于DNA復性研究，在這種情況下，探針和靶鏈在溶液中的濃度相同?，F代雜交實驗無論在液相雜交還是固相雜交均在探針過剩的條件下進行，此外，固相雜交中靶序列不在液相，故其濃度不能精確計算。
（5）雜交溫度：
雜交技術最重要的因素之一是選擇的雜交反應溫度。若反應溫度低于Tm的 10～15℃，堿基順序高度同源的互補鏈可形成穩定的雙鏈，錯配對減少。若反應溫度再低（Tm-30℃），雖然互補鏈之間也可形成穩定的雙鏈，但互補堿基配對減少，錯配對增多、氫鍵結合的更弱。如兩個同源性在50%左右或更低些的DNA，調整雜交溫度可使它們之間的雜交率變化10倍，因此在實驗前必須首先確定雜交溫度。
（6）雜交的嚴格性：
影響雜交體穩定性的因素決定著雜交條件的嚴格性。一般認為在低于雜交體Tm值25℃時雜交最佳，所以首先要根據公式計算雜交體Tm 值。通過調節鹽濃度、甲酰胺濃度和雜交溫度來控制所需的嚴格性。
（7）雜交反應時間：
在條件都得到滿足的情況下，雜交的成敗就取決于保溫時間。時間短了，雜交反應不完成；時間長了也無益，會引起非特異結合增多。一般雜交反應要進行20h左右。
（8）雜交促進劑：
體可用來促進250個堿基以上的探針的雜交率。對單鏈探針可增加3倍，而對雙鏈探針、隨機剪切或隨機引物標記的探針可增加高達100倍。而短探針不需用促進劑，因其復雜度低和分子量小，短探針本身的雜交率就高。
